CRISPR-Cas9诱导的DNA双链断裂可导致靶位点DNA甲基化丢失，该表观改变独立或伴随基因突变发生，机制涉及同源重组、结构变异及甲基化维护缺陷，且能稳定遗传。
最近，顶级期刊《基因组生物学》（Genome Biology）发表了一篇重磅研究，直接给炙手可热的CRISPR-Cas9基因编辑技术泼了一盆冷水：你以为只是剪断DNA、修一修基因序列就完事了？错！研究团队发现，CRISPR-Cas9在造成DNA双链断裂（DSB）的同时，还会严重破坏局部的DNA甲基化模式——也就是说，它不仅动了你的“遗传代码”，还顺手把你细胞里的“表观记忆”给抹了！
更可怕的是，这种表观层面的破坏不仅和基因突变同步发生，甚至还能在没有基因序列变化的情况下独立出现，而且能稳定传给子代细胞，这意味着你编辑一次，可能留下永久性的“表观伤疤”。
这项研究由沙特阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）李墨教授团队主导，第一作者王梦歌和张颖子并列贡献，利用前沿的纳米孔长读长测序技术，在人类胚胎干细胞和结直肠癌细胞中系统分析了CRISPR编辑对DNA甲基化的扰动，结果令人震惊。
作者背景：来自KAUST的表观基因组先锋团队
这项研究的通讯作者李墨（Mo Li）教授是沙特阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）生物科学与生物工程双聘教授，同时也是KAUST智慧健康卓越中心（KCSH）的核心成员。他的实验室长期聚焦于单细胞多组学、表观基因组编辑与干细胞命运调控，尤其擅长利用长读长测序（如Oxford Nanopore）技术解析复杂基因组结构与表观状态。李墨团队此前已有多篇关于CRISPR编辑引发的大规模结构变异（如大片段缺失、染色体易位）的高影响力工作发表于《自然·生物技术》《基因组生物学》等期刊。
本次研究第一作者王梦歌（Mengge Wang）和张颖子（Yingzi Zhang）均为KAUST博士生或博士后，两人在湿实验与干分析方面分工协作，配合默契。
有趣的是，几位作者都在X（原Twitter）上活跃，持续分享科研进展，体现了年轻一代科学家的开放精神。他们的研究不仅追求技术突破，更关注基因编辑临床应用的潜在风险——要知道，全球首个CRISPR疗法（用于治疗镰状细胞病）已在2024年获英美药监局批准上市，此时揭示其“表观副作用”，可谓恰逢其时、意义重大。
什么是DNA甲基化？为什么它比基因序列还“娇贵”？
在深入研究细节之前，我们得先搞懂一个核心概念：DNA甲基化。简单来说，它是在DNA的胞嘧啶（C）上加一个甲基（-CH₃）的化学修饰，主要发生在CpG二核苷酸（C后面紧跟G）上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。
这玩意儿可不得了，它不改变DNA序列本身，却能像“开关”一样调控基因是否表达。
比如，一个基因的启动子区域如果高度甲基化，那这个基因基本就被“关掉”了；
反之，低甲基化则可能激活基因。
更神奇的是，DNA甲基化还负责维持“基因组印记”——即某些基因只表达来自父亲或母亲一方的拷贝。像Prader-Willi综合征、Angelman综合征这类严重神经发育疾病，就是因印记控制区甲基化异常导致的。
此外，甲基化还能沉默转座子（“跳跃基因”）、维持染色体稳定、决定细胞身份（比如你是肝细胞还是神经元）。可以说，甲基化是细胞的“表观记忆”，一旦出错，轻则功能紊乱，重则致癌、加速衰老。而过去大家以为CRISPR只动“硬件”（DNA序列），不动“软件”（表观修饰），现在证明大错特错！
实验设计有多牛？长读长+无PCR+单倍型解析三位一体！
为了看清CRISPR编辑对甲基化的“真实影响”，团队采用了堪称教科书级别的实验设计。
首先，他们没有用传统的亚硫酸氢盐测序（bisulfite-seq），因为那玩意儿会把DNA剪得稀碎，还可能转化不完全，丢失单倍型信息。相反，他们用上了牛气冲天的纳米孔直接测序（Nanopore sequencing）——直接测天然DNA，既能读序列，又能同步检测5mC，关键是能产出超长读长（最长15.5 kb！）。
其次，为了富集目标区域又不引入PCR偏差，他们用了Cas9辅助靶向测序（CTS），即用体外Cas9蛋白+向导RNA把基因组切成特定片段，再只给这些片段加测序接头，实现无PCR富集。
最后，也是最关键的，他们利用单核苷酸多态性（SNP）对读长进行单倍型分型（phasing），从而能分别看父源和母源染色体上的甲基化状态——这在印记基因研究中至关重要。
整个流程从细胞培养（H1人胚胎干细胞和RKO结直肠癌细胞）、Cas9核糖核蛋白（RNP）电转、到纳米孔建库测序，每一步都精益求精。最终，他们在目标区域获得了至少242×的超高覆盖，足以支撑单分子级别的甲基化分析。
印记基因首当其冲！母源甲基化区域被CRISPR“精准爆破”
研究首先聚焦三个经典印记基因：SNRPN、PEG10和KCNQ1OT1。它们的差异甲基化区（DMR）在正常情况下呈现“双相模式”——比如SNRPN的母源等位基因高度甲基化，父源则几乎完全去甲基化。
团队分别设计sgRNA，在这些DMR内部制造DSB。结果发现，一旦Cas9开剪，母源等位基因的甲基化水平就显著下降！以SNRPN为例，非靶向对照组母源甲基化效率为90.45%，而靶向编辑后跌至84.90%（p<0.001）；PEG10也类似，从89.81%降至86.37%。
更惊人的是，这种甲基化丢失不是全有或全无，而是在单个DNA分子上呈现出“混乱模式”：有的读长完全变成父源样（“Opposite”模式），有的则甲基化/去甲基化区域交错出现（“Mosaic”模式）。
统计显示，靶向样本中异常甲基化读长比例显著高于对照（p<0.001）。而父源等位基因呢？几乎纹丝不动！这说明，高度甲基化的母源等位基因对DSB修复过程特别敏感，可能因为维持甲基化需要DNMT1等酶在复制后“补甲基”，而DSB修复打乱了这一过程。
不只是印记基因！癌细胞和异染色质也难逃“甲基化劫”
那么，这种现象是不是印记基因的特例？绝非如此！团队紧接着在两类非印记区域验证：
第一，RKO结直肠癌细胞中的MLH1基因。MLH1是DNA错配修复关键基因，其启动子在癌细胞中常因异常高甲基化（“表观突变”）而沉默。结果，靶向DSB后，MLH1甲基化水平从0.92骤降至0.73，显著丢失。
第二，H1干细胞中的两个异染色质区域UCA1和CRCT1——这些区域富含H3K9me3标记，通常高度甲基化。同样，Cas9一剪，甲基化就掉！UCA1从0.84降到0.67，CRCT1从0.88降到0.77。
这说明，无论基因组位置（常染色质/异染色质）、细胞类型（干细胞/癌细胞）、还是甲基化维持机制（印记/非印记），只要是高甲基化区域，就可能在DSB修复中丢失甲基化信号。这彻底打破了“只有特定区域才受影响”的幻想，意味着CRISPR的表观风险是普遍性的！
甲基化丢失怎么来的？三大机制齐上阵：同源重组、大片段变异、甲基化维护失败
那么，到底是什么机制导致了甲基化丢失？
团队通过单分子读长分析，揪出了三大元凶：
第一，同源重组（HR）或大片段结构变异（SV）。在部分异常甲基化的读长中，他们发现原本位于母源染色体的SNP“消失”了，取而代之的是父源SNP——这说明细胞在修复DSB时，用父源染色体当模板进行了同源重组，结果把母源的甲基化模式也“覆盖”成了父源样。
第二，大片段插入（≥30 bp）。纳米孔长读长优势在此凸显：他们检测到编辑样本中有大量随机来源的插入片段（有些长达10 kb！），其中约70%来自重复序列（如SINE转座子）。虽然这些插入不一定直接导致甲基化丢失，但可能扰乱局部染色质结构。
第三，也是占比最大的（约81%），是甲基化维护缺陷（defective methylation maintenance）——即DNA序列没变（没重组、没大片段变异），但修复过程中甲基化酶（如DNMT1）没能及时“补上”甲基，导致新生链去甲基化，并在后续复制中固化。这说明，DSB修复本身就会干扰表观维护机制，而不仅是靠“换模板”。
更可怕的是：这种“表观疤痕”能稳定遗传！编辑一次，影响终生？
那么，这种甲基化丢失是暂时的，还是会长久留下？
团队做了单细胞克隆实验：他们从编辑后的H1细胞中挑出103个单克隆，用亚硫酸氢盐测序筛查SNRPN甲基化状态。果然，一个克隆（命名为SNRPN-DMRMe/Me）表现出双等位基因都高度甲基化——这本不该出现在正常细胞中！
更关键的是，他们把这个克隆连续传代5次（相当于几十代细胞分裂），再用CTS测序确认：甲基化异常依旧稳定存在，且伴随一个20 bp的双等位基因缺失（证明它确实是编辑产物）。
这说明，DSB引发的表观改变不是“细胞应激反应”，而是能被细胞“记住”并传给后代的稳定表观突变。
想想看，如果你用CRISPR治疗遗传病，结果在修正致病突变的同时，不小心“固化”了一个致癌基因的去甲基化（激活）状态，那岂不是治好了旧病，埋下了新雷？
连“天然断裂”都逃不过！表观丢失是DSB修复的普遍规律
最后，团队问了一个更根本的问题：是不是只有Cas9这种“人工剪刀”才会导致甲基化丢失？还是说，任何DNA双链断裂（包括细胞自然发生的）？
为验证这点，他们分析了未编辑样本中的“天然小缺失”（≥2 bp，作为内源DSB修复的标志）。结果发现，在SNRPN和MLH1位点，天然缺失周围的CpG甲基化效率也显著低于对照（SNRPN：0.74 vs 0.80；MLH1：0.76 vs 0.80），且距离越近，丢失越严重。
这说明，甲基化丢失并非Cas9特有，而是人类细胞中DSB修复过程的普遍副产物。Cas9只是把这个过程“集中展示”了出来。
这也解释了为什么在衰老、癌症等DNA损伤累积的组织中，常观察到大范围低甲基化——可能正是无数次DSB修复留下的“表观伤疤”叠加所致。
总结与警示：基因编辑进入“表观安全”新纪元
一句话总结：CRISPR-Cas9造成的DNA双链断裂不仅会改变基因序列，还会破坏局部DNA甲基化模式，这种表观扰动可独立于突变发生、在多种基因组背景下普遍存在、并通过修复过程中的重组、结构变异或甲基化维护失败而产生，且能稳定遗传给子细胞。
这项研究首次在原生基因组环境中、以单倍型分辨率、同时捕获序列与甲基化变化，揭示了基因编辑被长期忽视的“表观代价”。
对于未来临床应用，这敲响了警钟：我们不能再只盯着“脱靶突变”，而必须系统评估“脱靶表观改变”。好消息是，团队也指出，或许可以反其道而行之——利用DSB诱导的甲基化丢失，来治疗那些由异常高甲基化导致的疾病（如某些癌症）。但前提是，我们必须更深入理解其机制，开发更安全的编辑策略（比如用dCas9融合表观酶，避免DSB）。
关键点：
CRISPR介入的DNA断裂或自然的DNA断裂 都可导致可遗传的表观遗传变化 ，这些变化发生在基因组大范围内，而不仅仅是在断裂处，也会破坏表观基因组！
极客辣评：
“磨损老化理论”已经正式过时了。
衰老并不是硬件坏了，而是软件出错了。
过去几十年，主流观点认为：人之所以会老，是因为身体像机器一样，随着时间推移被熵增、随机损伤、氧化、基因突变等物理性破坏慢慢“磨坏”了。
但新的“衰老信息理论”（ITOA）认为：细胞里那套年轻的“原始代码”其实一直都在，问题在于细胞渐渐读不懂它了。
关键在于“表观基因组”——它就像一套调控软件，告诉细胞自己该干什么。举个例子：神经细胞和皮肤细胞的DNA完全一样，区别只在于表观基因组打开了哪些基因、关闭了哪些基因。
最新研究发现，DNA双链断裂（DSB）就像一次“重大警报事件”。
一旦DNA断裂，细胞立刻拉响警报，把原本负责调控基因表达的蛋白（比如Sirtuins）紧急调去修复现场。
这就是所谓的“染色质修饰因子重定位”（RCM）假说。
修复完成后，问题来了：这些“维修工”并非全部能回到原来的岗位。它们“迷路”了。
日积月累，在一生中经历无数次DNA断裂（原因很多，比如辐射、代谢副产物等），越来越多的调控蛋白回不到原位，表观遗传的“指令”就越来越乱。细胞慢慢“忘记”自己是谁——比如肝细胞开始错误地表达5%的肾脏基因，功能不再精准。
这种“身份模糊”，就是衰老的本质。
强紫外线辐射是DNA断裂最常见情况，做好紫外线防护，日光浴 高原旅游尤其注意